DB46∕T 644-2024 咖啡果小蠹快速分子鉴定技术规程(海南省)
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.56 |
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页数： |
12 |
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文件格式： |
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日期： |
2024/10/20 |
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ICS 65.020．99,CCS B16,46,海南省地方标准,DB 46/T 644—2024,咖啡果小蠹分 子鉴定技术规程,Technical code for molecular identification of coffee berry borer,2024 - 09 - 23 发布 2024 - 11 - 01 实施,海南省市场监督管理局 发布,DB 46/T 644—2024,I,目次,前言 .III,引言 IV,1 范围 .1,2 规范性引用文件 1,3 术语与定义 .1,4 缩略语 1,5 咖啡果小蠹基本信息 1,6 原理 .1,7 主要仪器设备和主要试剂 .1,主要仪器设备 .1,试剂 2,8 分子鉴定操作步骤 .2,样品处理 2,DNA 提取 2,DNA 纯度和浓度测定 2,特异性引物使用 2,PCR 扩增反应 2,电泳及测序 2,9 结果判定 2,10 样品保存、复核与记录 2,样品保存 .2,复核 2,记录 2,附录A （资料性） 咖啡果小蠹基本信息 3,A.1 生物学特性 3,A.2 传播途径 3,A.3 地理分布 3,A.4 寄主 4,附录B （规范性） DNA 提取方法及PCR 检测方法 5,B.1 DNA 提取方法 5,B.2 引物序列 5,B.3 扩增反应体系 .5,B.4 扩增反应条件 .5,DB 46/T 644—2024,II,B.5 PCR 扩增片段电泳结果 5,B.6 PCR 扩增片段测序结果 6,B.7 结果判定 6,DB 46/T 644—2024,III,前言,本文件按照 GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的,规定起草,请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任,本文件由海南省农业农村厅提出并归口,本文件起草单位：中国热带农业科学院香料饮料研究所,本文件主要起草人：孟倩倩、王政、孙世伟、高圣风、苟亚峰、刘世超、田甜、温思为、薛超,DB 46/T 644—2024,IV,引言,2019 年 5 月，首次在海南省万宁市兴隆地区咖啡种植园中发现咖啡果小蠹入侵，标本经鉴定确定,为咖啡果小蠹，于 2019 年 6 月上报农业农村部。海南地区作为罗布斯塔咖啡主要产区，目前在海南,万宁、琼中、琼海等地均发现咖啡果小蠹为害,依据外部形态学特征对咖啡果小蠹的鉴定，需要昆虫分类专业人员和显微设备才能鉴别，特别是对,于卵、幼虫、蛹及特征脱落的残体等样本，存在鉴别难度大、耗时长等问题,鉴于以上原因，特制定本文件，可显著提高咖啡果小蠹检测效率，为咖啡果小蠹的口岸检疫、监测,防控提供必要的技术支撑,DB 46/T 644—2024,1,咖啡果小蠹分子鉴定技术规程,1 范围,本文件规定了咖啡果小蠹的缩略语、基本信息、原理、仪器和试剂、分子鉴定操作步骤、结果判定、,样品保存、复核与记录,本文件适用于植物及其产品中携带咖啡果小蠹的检疫和鉴定,2 规范性引用文件,本文件没有规范性引用文件,3 术语与定义,本文件没有需要界定的术语和定义,4 缩略语,下列缩略语适用于本文件,DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）,mtDNA COI：线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I,PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）,ddH2O：双蒸水（double distilled H2O）,5 咖啡果小蠹基本信息,咖啡果小蠹基本信息见附录 A,6 原理,不同物种间 mtDNA COI 序列存在片段差异，可根据种间序列的差异性设计特异性引物，通过 PCR,扩增，获得对应特异性片段，用于区分不同物种。根据咖啡果小蠹 mtDNA COI 特征，采用所设计特异,性引物对疑似样品进行 PCR 扩增，利用分子手段对咖啡果小蠹进行鉴定,7 主要仪器设备和主要试剂,主要仪器设备,研钵、水浴锅、纯水仪、漩涡振荡器、离心机、多功能酶标仪、冷冻冰箱、PCR仪、凝胶成像仪、,微量移液器（0.1 μL～2.5 μL、1 μL～10 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL）、电动碾磨器、无菌滤纸、,无菌枪头、离心管等,DB 46/T 644—2024,2,试剂,动物基因组 DNA 提取试剂盒、无水乙醇、ddH2O、蛋白酶 K: Proteinnase K，PCR 反应预混液：2×Taq,PCR MasterMix Ⅱ、琼脂糖（电泳纯）、TAE 缓冲液,除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂,8 分子鉴定操作步骤,样品处理,挑取疑似咖啡果小蠹虫体或部分残体组织放置在 2 mL离心管内，加入 1.5 mL无水乙醇浸泡,DNA 提取,DNA 提取方法按照 B.1 的规定执行,DNA 纯度和浓度测定,用多功能酶标仪测定 DNA 的纯度与浓度，分别读取 260 nm和 280 nm处的吸收值（记为 OD260和,OD280）。DNA的纯度计算方法为 OD260/OD280，范围应在 1.7～1.9，DNA 的浓度为 50 倍的 OD260（μg/mL）,DNA 的浓度与纯度应符合 PCR 反应的要求,特异性引物使用,特异性引物序列按照 B.2 给出的序列,PCR 扩增反应,按照 B.3、B.4 给出的方法执行,电泳及测序,PCR 产物电泳及测序按照 B.5、B.6 给出的方法执行,9 结果判定,按照 B.7 给出的方法执行,10 样品保存、复核与记录,样品保存,用无水乙醇将样品浸泡后置于 4℃冰箱妥善保存，样品至少……
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